488 caspase-3活细胞分析试剂盒说明书
产品描述
活细胞分析试剂盒包含 488 caspase-3底物和ac-devd-cho caspase-3/7抑制剂。 488 caspase-3 substrate为基于caspase-3/7活力检测细胞凋亡提供了有效的工具，适用于荧光显微观察和流式细胞仪分析。
相较于其它基于（flica）分析的 caspase 的荧光底物或荧光抑制，试剂盒内提供的substrate 检测caspase-3/7 活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。substrate由耦合caspase-3/7 devd识别序列的荧光dna染料组成。substrate 最初无荧光，其会穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中caspase-3/7剪切substrate释放高亲和性的dna 染料，这种染料迁移到细胞核标记dna 并发出明亮的绿色荧光。substrate 是双功能的，既可以检测 caspase-3/7 活性，又能可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。
使用方法
使用方法
1. 实验优化下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。488 substrate 可进行细胞长时间孵育过程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。推荐底物浓度1-10 μm之间。细胞可在培养基、pbs或其他的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞，建议更换新鲜含有底物的培养基，以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞等操作可自由选择。2. 对照设定
推荐设定以下对照：
a. 阴性对照：不诱导凋亡的细胞
b. 阳性对照：诱导凋亡的细胞
c. 抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时（或提qian10-30 min）孵育caspase-3/7抑制剂，最后再添加 488 caspase-3底物。
3. 抑制剂对照
试剂盒中所提供的caspase-3/7 抑制剂 ac-devd-cho 可用来确认caspase-3/7 依赖于 488 的荧光信号。对于抑制剂对照，抑制剂的终浓度应至少是底物浓度的2倍（例如当使用5 μm 488 底物时，ac-devd-cho浓度为 10 μm）。添加底物前在室温下孵育ac-devd-cho 15-30 min，加入底物后，孵育液中继续保留抑制剂。ac-devd-cho 是可逆的竞争性抑制剂。对于某些细胞类型有效的caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂，如z-devd-fmk，或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。
4. 流式细胞仪分析
4.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
4.2 对于贴壁细胞，实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。
4.3 用细胞培养基或合适缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到106个/ml数量级。
4.4 添加200 μl 细胞悬液至流式细胞试管。
4.5 抑制剂对照样本，用ac-devd-cho 处理细胞（见上文）。
4.6 200 μl细胞悬液中加5 μl 0.2 mm 的substrate并立即混匀使底物浓度为5 μm。不同类型细胞最佳底物浓度可能不同，需进一步优化。
4.7 室温避光孵育15-30 min。
4.8 加入300 μl细胞培养基或pbs，使用流式细胞仪分析，选择检测绿色荧光的通道（激发/发射：485/515 nm）。
5. 荧光显微镜观察
5.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
5.2 抑制剂对照样本，用ac-devd-cho 处理细胞（见上文）。
5.3 用含5 μm substrate 的新鲜培养基或pbs对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。
5.4 室温孵育30 min 或更长时间。
5.5 pbs或其它缓存液清洗细胞，荧光显微镜观察细胞，使用观察绿色荧光的滤片（激发/发射：485/515 nm）。
6. 荧光酶标仪检测
6.1 将贴壁细胞生长在黑色96孔板中；对于悬浮细胞，调整密度至106个/ml，每孔加入0.2 ml细胞悬液。
6.2 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。（注意：细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到 96孔检测板。）
6.3 抑制剂对照样本，用 ac-devd-cho 处理细胞（见上文）。
6.4 对于悬浮细胞，直接添加substrate 混匀。对于贴壁细胞，用含有5 μm substrate的新鲜培养基或pbs对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。
6.5 细胞可以在含有substrate 的培养基中直接观察。
6.6 对于悬浮细胞，轻轻震荡重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部阅读方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。
运输及保存方法
冰袋（wet ice）运输。储存于4ºc，至少可以储存12个月。
注意事项
1、细胞可用hoechst 33342 染料（推荐浓度1 μm）共染，使细胞核产生蓝色荧光染色（ex/em=346/460 nm）。
2、488 染料可用甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。
3、经甲醛固定的488染色细胞可用0.1% tritonx-100处理后行后续染色，但这样处理后的染色亮度可能会减弱。
4、操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。5、本产品仅作科研用途！
货号 品名 规格 品牌
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